常見的PCR反應(yīng)抑制物一覽

一個PCR反應(yīng)過程分為很多的步驟，同時也受到很多因素的影響，可以分為內(nèi)部因素和外部因素，內(nèi)部因素是指正常試劑體系中的成分，外部因素是指環(huán)境或者樣本帶入的因素。

體系內(nèi)部因素

引物：引物是整個PCR體系最重要的部分，也是決定一個PCR反應(yīng)特異性的關(guān)鍵，引物在設(shè)計時要遵守一定的原則（長度、擴(kuò)增跨度、堿基等）。

酶及其濃度：目前有兩種Taq DNA聚合酶，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸桿菌合成的基因工程酶，酶濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度：dNTP溶液呈酸性，一般配置成體系需將其調(diào)節(jié)至7.0-7.5，正常情況下4種dNTP的濃度應(yīng)該相等，如果其中某一種過高就會引起錯配，濃度過低又會引起PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。

模板核酸（靶標(biāo)）：模板核酸的量和純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，對于RNA模板更要注意RNA的降解。

Mg2+濃度：主要影響PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量，一般要對應(yīng)dNTP的濃度。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

溫度與時間的設(shè)置：PCR原理三步驟涉及變性-退火-延伸三個溫度點，也就是變性溫度與時間、退火（復(fù)性）溫度與時間、延伸溫度與時間。

循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般溫度循環(huán)次數(shù)在30-40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量就越多。

其他抑制劑

除上述抑制劑外，還存在一定的PCR增強(qiáng)劑，比如甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、PEG、亞精胺和單鏈DNA結(jié)合蛋白等，但是在高濃度情況下，也會對PCR產(chǎn)生抑制，因此如何采用增強(qiáng)劑消除抑制劑的影響，采用多少的濃度對結(jié)果都存在很大的影響。

臨床PCR常見問題

1假陽性問題

方法學(xué)問題：靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴(kuò)增

污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染、產(chǎn)物污染

解決辦法：嚴(yán)格區(qū)分試驗區(qū)域及人員培訓(xùn)，使用UNG技術(shù)

2假陰性問題

問題來源：試劑因素、操作因素、儀器因素、標(biāo)本因素

解決辦法：

設(shè)置陽性對照監(jiān)測試劑問題

降低操作難度，提高操作人員水平

室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)控監(jiān)控

使用抗干擾能力強(qiáng)的試劑提取樣本